GenetikaGenetski inženjering

CRISPR-Cas9 Sistem, genetski inženjering

CRISPR, bakterije, genom, dna, dnk, medicina, zdravlje

CRISPR Cas9 je sistem za izmenu gena. Predstavlja pravu revoluciju u molekularnoj biologiji. Sama metoda je brza, jeftina, mnogo preciznija od ostalih i ima široku mogućnost upotrebe. Ovaj jedinstven način omogućava izmene u genomu tako što iseca, zamenjuje ili dodaje određen deo DNK sekvence.

Sam sistem kao i većina stvari u biologiji potiče od bakterija. CRISPR (eng. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) je imunološki sistem ovih jednoćelijskih mikroorganizama koji ih brani od virusnih infekcija. Prvi put je otkriven kod E. coli 1987. godine. Mnoge bakterije u svojim hromozomima imaju sekvence kratkih ponovaka između kojih se nalaze delovi virusne DNK (slika 1.).

cas geni, crispr lokusi, hromozom, bakterije, arheje
Slika 1. Na slici je prikazan bakterijski hromozom koji sadrži DNK ponovke (crni heksagoni), a između njih se nalaze sekvence virusne DNK (kvadratići u boji) koji predstavljaju tragove ranijih infekcija. Ovakva DNK koduje Cas gene, a oni sintetišu proteine koji služe za odbranu od ponovne infekcije istim bakteriofagom.
Foto Credit:
Zona Medicine®

Ali naučnici tada nisu znali čemu služi virusna DNK. Kasnije su uvideli da se te virusne sekvence često javljaju u sekvencama gena (CAS – Crisper Associated Genes) koji kodiraju određene enzime, poput onih koji vrše popravku DNK (npr. endonukleaze). Naučnici (Bolitin et al., Mojica at al., Pourcel et al.) su 2005. godine postavili hipotezu da je CRISPR sistem nazvan po ponavljajućim sekvencama zapravo imuni odgovor bakterija protiv virusa. Sistem dozvoljava ugradnju virusne DNK u sam genom bakterije, te se bakterija kasnije nekako bori protiv infekcije istim virusom. Tokom narednih nekoliko godina naučnici: Horvath & Barrangou (2010) „Sceince“ i Wiedenheft et al. (2012) „Nature“, su potvrdili hipotezu o CRISPR mehanizmu.

Kako CRISPR Cas9 funkcioniše?

Funkcionisanje ovog sistema se jednostavno objašnjava pomoću druge i treće ilustracije. Na slici 2. bakterija prvi put dolazi u dodir sa virusnim materijalom, dok na slici 3. već je ranije bila u kontaktu. Kada se u bakteriji nađe DNK sa kojom prvi put dolazi u dodir sintetišu se CAS proteini klase 1 koji hvataju DNK uljeza. Zarobljen genetski materijal nije u stanju da inficira bakteriju, već se odlže u bakterijsku DNK, tj. u CRISPR sistem, gde će poslužiti u odbrani tokom sledećeg prodora stranog genetskog materijala (slika 2).

 

 

crispr cas9
Slika 2. Funkcija CRISPR Cas9 sistema kod prvog kontakta sa virusnom DNK Bakteriofag ubacuje svoju DNK u bakteriju. Bakterija dolazi prvi put u kontak sa njom (1). Kao odbrambeni mehanizam Cas geni smešteni u bakterijskom DNK sintetišu Cas Protein klase I (2). Protein hvata DNK, onesposobljava je (3). Na kraju ona se ugrađuje u genetski kod bakterije, tj. gradi CRISPR sistem (4).
Slika 3. Funkcija CRISPR Cas9 sistema kod svakog narednog kontakta sa virusnom DNK Bakteriofag ubacuje svoju DNK u bakteriju (1). Kao odbrambeni mehanizam Cas geni smešteni u bakterijskom DNK sintetišu Cas protein (2). Strana DNK koja je već inkorporirana u genom bakterije sintetiše vodič RNK (3). Sintetisana RNK se spaja sa CAS proteinom (4). Zajedno eliminišu virusnu DNK (5).
Foto Credit:
Zona Medicine®
CRISPR i cas9 protein

Nakon 2005. godine dr Jennifer Doudna (UC Berkeley) sa svojim timom i još jednim na čelu sa dr Emmanuelle Charpentier nastavljaju istraživanje koje se oslanja na pomenutu hipotezu. One su proučavale pojednostavljen CRISPR sistem bakterije Streptococcus pyogenes koji se oslanja na protein Cas9. Ovaj protein pripada endonukleazama. Sastoji se od tri komponente koje uključuju dva mala RNK molekula. 2012. godine one su rekonstuisale protein u dvokomponentni sistem tako što su spojile dva RNK molekula u jednu „samo-navođenu RNK“ (gRNK, eng. guidance RNK) koja kada se spoji sa Cas9 može da preseče DNK na ciljnoj sekvenci. Navođenje endonukleaze omogućava tzv. „single-guide RNK“. Sekvenciranjem RNK za navođenje, veštački Cas9 sistem se tako programira da pogađa bilo koju željenu sekvencu DNK, te može da je prkine (slika 4).

 

cas9, grnk, endonukleza, mutacija, crispr cas9
Slika 4. CRISPR-Cas9 eliminiše specifičan gen Cas9 proten sa endonuklazom je spojen sa „navodećom RNK“ (gRNK) te grade dvokomponentni sistem. Na gRNK je laboratorijski ugrađena odgovarajuća sekvenca RNK koja će razmotati DNK na specifičnom mestu. Dejstvom endonukleaza na DNK ona će biti prekinuta, mehanizam za oporavljanje DNK se aktivira i dolazi do mutacije, ali je željeni gen neutralisan. Na sličan način bore se i bakterije protiv DNK bakteriofaga.
Foto Credit:
Zona Medicine®

CRISPR-cas9 sistem ima mogućnost da na mesto odstranjenog gena doda odgovarajuću RNK, onda će od nje da bude sintetisan željen gen (slika 5.). Još jedna osobina ovog sistema je mogućnost da menja DNK u živoj ćeliji, na više mesta. Sistem bi mogao da funkcioniše na primer kod pacijenta koji imaju cističnu fibrozu. CRISPR-cas9 će neutralisati gen koji dovodi do bolesti. Naučnici se nadaju da će u budućnosti uz pomoć ove tehnologije uspeti da izleče mnoge genetski nasledne bolesti. Shodno tome u ovoj oblasti sledi niz naučnih istraživanja i otkrića.

crispr cas9
Slika 5. CRISPR-Cas9 posle eliminacije dodaje željenu RNK Dejstvom endonuklaze odstranjen je neželjen gen (1). Na njegovo mesto potrebno je ubaciti željenu RNK (ljubičasta boja). Od RNK se sintetiše DNK (3).
Foto Credit:
Zona Medicine®

 

Literatura:

  • Predavanja prof. dr Jennifer Doudna