Mikrobiologija

Opšta Mikrobiologija: 16-22

16. Konjugacija

Prenos DNK koji se obavlja direktnim kontaktom dve bakterijske ćelije. Eksperimenti su vršeni sa sojevima E. Coli. Uočeno je da se razmena odvija samo sa određenim sojevima, od kojih je jedan mora da ima faktor fertiliteta. Prenos se odvijao između sojeva koji imaju faktor fertiliteta – muška ćelija i sojeva bez faktora fertiliteta – ženska ćelija. Daljim proučavanjem tokom godina utvrđeno je da konjugacija nije oblik seksualne reprodukcije, jer nema jednakog učešća obe roditeljske ćelije u formiranju zigota. Suprotno tome, proces konjugacije se sastoji od prenosa jednog segmenta DNK iz donorkse (muške) ćelije u recipijentu (žensku) ćeliju.

F faktor je prvi otkriveni plazmid koji može da omogući konjugativni transfer DNK u recipijentnu ćeliju. Naziva se konjugovani plazmid. Oni koji ne mogu da sprovedu konjugativni transfer označavaju se kao nekonjugovani plazmidi.

Kod većine konjugovanih plazmida transfer region obuhvata dvadesetak gena koji kodiraju: izgradnju seks pila, sintezu enzima za spajanje membrana, formiranje citoplazmatskog tunela, itd.

Mehanizam konjugacije:

  • kontakt između dve bakterije i spajanje seks pilima,
  • fuzija membrana i nastanak citoplazmatskog tunela,
  • jedan lanac DNK se od donora prenosi. Onaj koji ostaje replikuje se u donoru, isto važi i za onog koji ide u recipijenta.

Replikacija plazmidske DNK nije sinhronizovana sa deobom hromozoma. Tako da jedna od ćerki ćelija ostaje bez F faktora. Na taj način se u prirodi održava ravnoteža između brojeva muških i ženskih ćelija.

 

17. Plazmidi i transpozoni

Plazmidi

Ekstrahromozomske strukture koje se samostalno replikuju. Slični su bakteriofagima, ali nemaju stabilan ekstracelularni oblik. Sastoje se iz dvolančane DNK koja je spiralno uvijena, a krajevi su spojeni. Postoje:

  • konjugovani plazmidi koji sadrže informacije za sintezu fimbrija, formiranje citoplazmatskog mosta i transport DNK u recipijenta;
  • R plazmidi imaju gene za rezistenciju na antibiotike.

Plazmidi su faktori virulencije, nisu neophodni za život bakterija.

Transpozoni

Transpozoni su DNK segmenti koji mogu da se premeštaju sa jedno na drugo mesto u bakterijskom hromozomu ili sa hromozomsku na plazmidsku DNK i obratno. Zovu se još i transpozibilni elementi. Dele se na tri grupe:

  • Insercione sekvence. Najjednostavniji transpozoni, imaju lepljive krajeve. Najčešće su ugrađeni u hromozom bakterija, a mogu da se integrišu sa plazmidom i baktriofagom.
  • Transpozoni. Veći su od prethodnih. Dele se na kompozitne i TnA transpozone. Kodiraju sekvence za otpornost na antibiotike, toksične supstance, itd.
  • Transpozoni udruženi sa bakteriofagom. Zovu se još i transpozibilni bakteriofagi: Mu i D108. Koriste transpoziciju za fiziološki put reprodukcije. Mu fag posle infekcije se ugradi u bakterijski hromozom.

Replikacija transpozona. Transpozicija se odigrava u zoni određenih ciljnih sekvencija na dva načina:

Prvi: Transpozibilni element se premešta sa svog prethodnog mesta insercije na novu lokaciju (konzervativna transpozicija). Određeni elementi kao što su IS 10 i IS 50 koriste samo ovaj put transpozicije.

Drugi: Drugom obliku transpozicije prethodi duplikacija elemenata, zatim se jedna kopija premešta, a druga ostaje na svom prvobitnom položaju. Ovakav način koriste transpozoni TnA grupe.

 

18. Antibakterijski lekovi – definicija i osnovni mehanizmi delovanja

Antibakterijski lekovi su antibiotici i hemioterapeutici. Oni ubijaju mikroorganizme ili sprečavaju njihovo razmnožavanje u živom organizmu. Deluju baktericidno i bakteriostatski.

Antibiotici su prirodni biološki produkti gljivica. Hemioterapeutici su produkti hemijske sinteze, prave se u laboratoriji.

Razlikujemo lekove prvog i drugog izbora, ili njihove kombinacije. Osobine ovih lekova su:

  • selektivna toksičnost,
  • deluju u dovoljnoj koncentraciji,
  • širok spektar delovanja,
  • takva struktura da se što kasnije razvije rezistencija.

Mehanizmi delovanja lekova

  1. inhibicija sinteze ćelijskog zida,
  2. inhibicija funkcije citoplazmatske membrane,
  3. inhibicija sinteze proteina,
  4. inhibicija sinteze nukleinskih kiselina,
  5. inhibicija mehanizma folata.

 

19. Lekovi koji inhibišu sintezu ćelijskog zida

Lekovi u ovoj grupi su:

  • beta laktami: penicilini, cefalosporini, karbapenemi, monobaktami.
  • glikopeptidi: vankomicin.
  • fosfamicin.
  • cikloserin.

Beta-laktami

Ovoj grupi pripada veliki broj antibiotika. Dejstvo ispoljavaju preko beta laktamskog prstena. Beta-laktami deluju tako što inhibišu sintezu peptidoglikana. Efekat je liza ćelije. U fazi razmnožavanja deluju baktericidno, a kad se ne razmnožavaju deluju bakteriostatski. Deluju na dva načina:

  1. vezivanje za Pencilin Binding Proteins (dolazi do lize),
  2. sprečavanje sinteze inhibitora autolitičkih enzima u ćelijskom zidu.

L-oblici, sferoplasti i protoplasti nastaju dejstvom β-laktama. Efekat ovih lekova zavisi od:

  • penetracije kroz porine,
  • afinitet prema PBP,
  • otpornost na β-laktamaze.
Pencilini

Osnovna hemijska struktura penicilina je 6-aminopenicilinska kiselina koja se sastoji od β-laktamskog prstena i tiazolidinskog prstena. Dele se na naturalne i polusintetske.

Naturalni

Osnovni penicilin je G-penicilin, njegov blizak srodnik je V-pencilin. Ograničeni su na Gram pozitivne i negativne koke. Lek izbora je za infekcije gornjih respiratornih puteva izazvane streptokokama. Osetljivi su na penicilinaze.

Polusintetski penicilini

Dobijaju se iz naturalnih delovanjem enzima i kiselina kako bi se ogolio osnovni molekul (penicilinska kiselina) i na nju se dodaju razni radikali u cilju povećanja otpornosti na beta-laktamaze i penicilinaze. Dodavanjem radikala širi se i spektar delovanja. Dele se na:

  • penicilinaza rezistentne penciline:  meticilin i  kloksacilin.
  • penicilini širokog spektra dejstva: aminopenicilini (ampicilin, amoksaciklin); karboksipenicilini (karbenicilin); acilureidopenicilini (mezlocilin, azlocilin, piperacilin). Penicilini otporni na β-laktamaze (klavulonska kiselina, sublaktam).

Neželjeni efekti penicilina jesu preosetljivost, rezistencija i tolerancija od strane bakterija. Dobra osobina je ta da su minimalno toksični.

Cefalosporini

Dele se u četiri generacije, gde poslednje dve predstavljaju strateške rezerve. Cefalosporini gotovo da nemaju neželjena dejstva.

I generacija:

  • cefaleksin,
  • cefalotin.

II generacija. Rezistentni su na cefalosporinaze, aplikuju se samo parenteralno.

  • cefamandol,
  • cefuroksim,
  • cefoksitin.

III generacija:

  • cefotaksim,
  • ceftriakson,
  • ceftazidim,
  • cefpodoksim.

IV generacija:

  • cefepim,
  • cefpirom.

Monobaktami

Otporni su na β-laktamaze, deluju samo protiv Gram negativnih bakterija. Predstavnik je aztreonam.

Karbapenemi

Imaju najširi spektar delovanja. U velikim dozama su nefrotoksični. Predstavnik je imipenem.

Glikopeptidi

Primenjuje se kod teških infekcija. Predstavnik je vankomicin. Aplikuje se samo parenteralno. Koristi se za terapiju teških infekcija koju izazivaju bakterije otporne na peniciline. Primenjuje su u slučaju alergije na beta-laktamske antibiotike. Primarno je indikovan za terapiju infekcija izazvanih meticilin-rezistentnim stafilokokama (MRSA). U velikim dozama je hepato, nefro i ototoksičan.

Lekovi koji inhibišu funkcije citoplazmatske membrane

Polimiksin. Deluje na plazmalemu tako da ona izgubi svoju permeabilnost. Deluju na mnoge Gram negativne bakterije, ali imaju ograničenu primenu zbog svoje nefro i neurotoksičnosti. Slično deluje i Colistin (Polymyxin E).

Polienski antibiotici. Predstavnici su nistatin (Nystatin) i amfotericin B. Vezuju se za sterole koje imaju samo ćelije gljivica, ali ne i bakterija. Nemaju efekata na bakterije.

Imidazol. Predstavnici su mikonazol i flukonazol koji direktno oštećuju plazmatsku membranu.

 

20. Lekovi koji inhibišu sintezu proteina i nukleinskih kiselina

Inhibitori ribozomskih podjedinica 30s
  • aminoglikozidi: streptomicin (ototoksičan), gentamicin, tobramicin, neomicin i kanamicin, amikacin.
  • spektinomicin,
  • tetraciklini: hlorotetraciklin, oskitetraciklin, doksiciklin, minociklin.

Neželjeni efekti aminoglikozida su nefrotoksičnost i ototoksičnost. Retko izazivaju alergijske reakcije.

Spektinomicin je sličan aminoglikozidima. Aplikuje se intramuskularno. Koristi se protiv gonoreje ili kod alergije na penicilin.

Neželjen efekat tetraciklina je teksičnost na kosti, odnosno na razvoj kostiju i gleđi, potamnjivanju zuba kod dece. Kontraindikovani su u trudnoći i za decu do 12 godina. Relativno se često javljaju poremećaji crevne flore, kolonizacija kandidom crevne i vaginalne sluznice. Ovaj efekat zavisi od doze leka. Česta rezistencija.

Inhibitori ribozomskih podjedinica 50S

Inhibitori ribozomskih podjedinica 50s su hloramfenikol, makrolidi, linkomicin, klindamicin, fusidinska kiselina.

Neželjen efekat hloramfenikola je anemija, veoma redak. Lakši oblici neželjenog dejstva je reverzibilna depresija kostne srži sa anemijom i leukopenijom. Kod nedonoščadi i novorođenčadi može se javiti sindrom „sive bebe“ zbog nedovoljno razvijene aktivnosti enzima glukuronil-transferaze.

U makrolide spadajui: eritromicin, azitromicin, klaritromicin.

Lek izbora kod alergičnih na penicilin, neželjenih efekata gotovo i nema.

Lekovi koji inhibišu sintezu nukleinskih kiselina
  1. nhibitori sinteze DNK: hinoloni i fluorohinoloni. Predstavnik je ciprofloksacin.
  2. Inhibitori sinteze RNK: rifampicin.

Lekovi koji inhibišu metabolizam folata

Sulfonamidi inhibišu sintezu folne kiseline. Deluje bakteriostatski jer bez folne kiseline bakterija nemože da raste i da se deli.

Timetoprim inhibiše dihidrofolat reduktazu i sintezu purina. Deluje baktericidno.

Neželjeni efekti su najčešće alergijske reakcije.

Paraaminosalicilna kiselina (PAS)

Ova kiselina deluje slično kao i sulfanomidi. Lek je efikasan u borbi protiv Mycobacterium tuberculosis. Nedostatak je to što se razistencija razvija vrlo brzo, te se koristi kao tuberkulostatik II reda.

Izoniazid je tuberkulostatik I reda. Ali postoje rezistenti oblici, te se preporučuje kombinacija izonazida sa etambultolom ili rimfapicinom.

Cikloserin deluje inhibicijom sinteze ćelijskog zida. Koristi se za terapiju samo tuberkuloze, ima sinergistički efekat sa streptomicinom.

Metronidazol je lek koji se koristi u terapiji amebijaze i trihomonijaze. Ali odlično funkcioniše protiv još nekih bakterija. Pri dugotrajnoj terapiji visokim dozama štetno deluje na CNS.

 

21. Rezistencija bakterija na lekove

Kada bakterija razvije sistem za odbranu od nekog antibiotika, kažemo da je rezistentna na taj lek.

Mehanizmi rezistencije bakterija na lekove:

  1. enzimska destrukcija ili inaktivacija leka;
  2. izmena ciljnog enzima,
  3. izmena propustljivosti ćelijskih ovojnica,
  4. izmena strukture ribozoma,
  5. izmena metaboličkog puta.

Enzimska destrukcija ili inaktivacija leka je najčešći mehanizam rezistencije na beta-laktame. To su litički enzimi koji razgrađuju beta-laktamski prsten i pretvaraju ga u inaktivnu supstancu. Nazivaju se beta-laktamaze (penicilinaza i cefalosporinaza). Mogu biti inducibilne (luče se samo u prisustvu leka) ili konstitutivne (uvek prisutne). Mogu biti ekstracelularne, pa tako štite i druge bakterije u okolini. Produkuju ih Gram pozitivne bakterije. Gram negativne produkuju beta-laktamaze u periplazmatski prostor. Enzimi su koncentrovaniji (zbog manjeg prostora) te su ove bakterije otpornije na beta-laktame. Geni za kodiranje ovih enzima su najčešće plazmidskog ili transpozonskog porekla. Inhibitori penicilinaa su: klavulonska kiselina i sulbaktam.

Izmena ciljnog enzima je mehanizam koji je važan za peniciline jer se odnosi na izmenu sposobnosti ovih lekova da se vežu za ciljne enzime koji se nalaze u citoplazmatskoj membrani bakterija – PBP. Najbolji primer je MRSA.

Izmena propustljivosti ćelijskih ovojnica se odnosi na promenu propustljivosti porina i smanjenje ulaska leka u ćeliju. Alteracija porina je značajna za rezistenciju na beta-laktame, fluorohinolone i tetracikline.

Izmena strukture ribozoma. Izmena ove strukture nastaje na mestu gde se lek obično vezuje za ribozom i posledica je delovanja različitih enzima na ribozomalnu RNK bakterija. Ova pojava je najčešće indukovana. Ovim mehanizmom se postiže rezistencija na tetracikline, makrolide i aminoglikozide.

Izmena metaboličkog puta. Ovim mehanizmom razvija se rezistencija na sulfonamide, trimetoprim i fluorohinolone.

Poreklo rezistencije

Urodjena rezistencija. Nedostatak neke strukture te lek ne deluje. Primer su mikoplazme jer nemaju ćelijski zid. Ove bakterije nemaju ćelijski zid tako da su otporni na lekove koji inhibišu sintezu petidoglikana. Još jedan primer su bakterije koje stvaraju acetiltransferazu i urođeno su otporne na streptomicin.

Stečena rezistencija:

  • genetička. Promene u genima. Može biti hromozomska i ekstrahromozomska: plazmidi i transpozoni.
  • negenetička. Kada su bakterije u fazi mirovanja otporne su na neki lek, a u fazi razmnožavanja su osetljive. Primer su Mycobacterium tuberculosis i L-oblici.

 

22. Ispitivanje osetljivosti bakterija na antimikrobne lekove.

Ispitivanje osetljivosti mikroorganizama na antibiotike i hemioterapeutike in vitro naziva se antibiogram. Tehnike koje se koriste za dobijanje antibiograma su:

  • difuzioni metod,
  • dilucioni metod,
  • kombinacije ovih metoda.

Difuzioni metod

Metod se zasniva na principu difuzije antimikrobnog leka u čvrstu hranljivu podlogu, pri čemu on deluje manje ili više inhibitorno na bakterije koje su prethodno zasejane na tu podlogu.

Standardna hranljiva podloga za ispitivanje osetljivosti na antimikrobne lekove (Muller-Hinton agar) zaseje se suspenzijom određene gustine čiste kulture ispitivanog soja (inokulum), koja se uz pomoć brisa ili staklenog štapića ravnomerno raširi po celoj površini agara.

Nakon stajanja podloge 10-15 minuta na sobnoj temperaturi, na zasejanu i prosušenu površinu podloge pincetom se stavljaju diskovi ili tablete natopljene sa antimikrobnim lekom. Koncentracija leka odgovara onoj koja se postiže u organizmu primenom uobičajenih doza leka. Zasejane podloge se inkubiraju 18-24h na odgovarajućoj temperaturi (35-37oC).

Nakon inkubacije na podlozi se vide kolonije bakterija na delovima podloge sa niskom koncentracijom antibiotika. Ako je zasejana bakterija osetljiva na određeni antibiotik, ona neće porasti u zoni njegove aktivnosti (zona inhibicije rasta). Širina zone inhibicije predstavlja stepen osetljivosti bakterije i ako su svi uslovi standardizovani (veličina inokuluma, sastav i debljina podloge, njena vlažnost i pH, vreme inkubacije) onda je prečnik zone inhibicije proporcionalan koncentraciji leka.

Prečnik zone inhibicije rasta meri se milimetarskom hartijom, a procena se vrši na osnovu kriterijuma koje daje proizvođač diskova ili tableta. Na osnovu toga bakterija se svrstava u jednu od tri kategorije:

  • S (sensitive) – osetljiva,
  • I (intermediate) – umereno osetljiva,
  • R (resistant) – otporna.

Difuzioni metod je jednostavan za izvođenje, brz, relativno jeftin i omogućuje istovremeno ispitivanje osetljivosti na veći broj lekova. Najčešće se koristi u rutinskom radu. Ovom metodom se ne može odrediti minimalna inhibitorna ni minimalna baktericidna koncentracija, već moramo koristiti dilucioni metod.

 

Dilucioni metod

Ovaj metod se sastoji u korišćenju dvostrukih razblaženja antibiotika ili hemioterapeutika, koja se ugrađuju u tečnu podlogu ili u agar, pa se u zavisnosti od toga razlikuju bujon dilucioni i agar dilucioni metod.

Bujon dilucioni metod u epruvati

U niz sterilnih epruveta sipa se jednaka količina tečne podloge za razmnožavanje bakterija, izuzev u poslednju, kontrolnu epruvetu u koju se stavlja dvostruko više podloge.

U epruvete se dodaju dvostruka razređenja ispitivanog antimikrobnog leka. U kontrolnu epruvetu ne dodaje se antimikrobni lek. Zatim se u svaku epruvetu inokuliše jednaka količina kulture bakterije koja se ispituje (inokulum).

Epruvete se inkubiraju 18-24h, na 35-37oC, a zatim se čita rezultat. Ukoliko je bakterija preživela koncentraciju leka u podlazi se vidi zamućenje, kao i u kontrolnoj epruveti. Podloge u kojima je došlo do inhibicije razmnožavanja ili smrti bakterije ostaju iste.

Najmanja koncentracija antimikrobnog leka koja inhibira rast i razmnožavanje bakterija (prva epruveta u kojoj nema zamućenja) naziva se minimalna inhibitorna koncentracija (MIK). Ovo je koncentracija koja deluje bakteriostatski.

Da bi se odredili minimalna baktericidna koncentracija (MBK) tj. najmanja koncentracija leka koja ubija ispitivanu bakteriju (baktericidno dejstvo) vrši se presejavanje sadržaja epruveta u kojima nema zamućenja i sadržaja kontrolne epruvete na čvrstu podlogu bez antibiotika. Podloge se inokuliraju  18-24h na 35-37oC. Ukoliko na podlazi nema porasta  bakterijskih kolonija koncentracija leka u epruveti iz koje je izvršeno presejavanje predstavlja minimalnu baktericidnu koncentraciju. MBK predstavlja onu koncentraciju leka koja ubija 99,99% bakterijskog inokuluma u poređenju sa kontrolnom. Ovaj metod daje precizne podatke o MIK i MBK, što je značajno pri doziranju antimikrobnih lekova, ali je znatno složeniji za izvođenje od difuzionog metoda, duže traje (48h) i može se odrediti osetljivost na samo jedan antibiotik.

 

Agar dilucioni metod

Ispitivanje se izvodi na četvrtastoj podlozi u koju su ugrađena dvostruka stepenasta razblaženja antimikrobnog leka. Zasejavanje inokuluma može se izvoditi povlačenjem paralelnih linija po podlozi ezom ili nanošenjem kapi suspenzije bakterija mikropipetom. Ovim metodom može se istovremeno ispitati osetljivost velikog broja sojeva (15, 25 i više). Nakon inkubacije čitaju se rezultati. Samo one bakterije koje su rezistentne na koncentraciju leka ugrađenu u podlogu daće vidljivi porast na podlozi.

 

Kombinacija difuzionog i dilucionog metoda

E – test (Epsilometar test)

Difuzioni metod je jednostavniji za izvođenje, a dilucioni je precizniji i predstavlja pomoć u doziranju terapije, zato je korisno primenjivanje kombinacije ovih metoda. E-test predstavlja određivanje MIK difuznom metodom. Pri tome se koriste plastične trake impregnirane antimikrobnim lekom, ali ne homogeno kao diskovi, nego sa opadajućim gradijentom koncentracije. Nekon inhibicije, oko plastičnih traka nastaje zona inhibicije rasta nepravilnog oblika, šira u delu gde je koncentracija leka veća, a zatim sve uža. Mesto presecanja granične linije zone inhibicije rasta i trake označava MIK (vrednost se očitava na skali trake).

Tumačenje razultata antibiograma

Bakterije su prema stepenu osetljivosti na antimikrobne lekove u difuzionom antibiogramu svrstavaju u tri kategorije obeležene slovima S, I i R.

  • S (osetljiv) znači da se u terapiji dobri rezultati postižu davanjem uobičajenih dnevnih doza antimikrobnog leka.
  • I (umereno osetljiv) znači da treba primiti veće doze leka od uobičajenih dnevnih, ili primeniti neki drugi, efikasniji antibiotik ako je moguće.
  • R (rezistentan) znači da se dati lek ne može koristiti u terapiji infekcije.

Uzrok neuspeha terapije osim rezistencije može biti i pojava koja se naziva tolerancija na antimikrobne lekove. Kod nekih bakterijskih vrsta zapaža se da uobičajene doze leka ne deluju baktericidno nego samo bakteriostatski, tj. da je kod ovih sojeva količnik MIK/MBK veći nego obično. Odnos MIK/MBK obično iznosi ¼, a kod tolerantnih sojeva on je 1/32 ili veći. Kao posledica neuspeha terapije zbog tolerancije javlja se perzistencija infekcije i ponekad komplikacije.

Ova pojava prvo je uočena kod Streptococcus pyogenes-a, ali se javlja i kod nekih drugih vrsta.